|
Stem Cell / Regenerative Medicine
พื้นฐานเซลล์ต้นกำเนิด
Basic of Stem Cells/Regenerative Medicine
โดย น.สพ.ศุภเสกข์ ศรจิตติ
รูปไม่มา ใครอยากดูรูปประกอบให้ไปตาม Link คห.1 ครับ
สเต็มเซลล์ หรือที่ภาษาไทยใช้คำว่า เซลล์ต้นกำเนิด หลายคนอาจเข้าใจว่าเซลล์ต้นกำเนิดนี้สามารถสร้างได้เพียงเม็ดเลือดชนิดต่างๆ เท่านั้น แต่ในข้อเท็จจริงนั้น สเต็มเซลล์ที่สร้างเม็ดเลือดนั้นเป็นเพียงชนิดหนึ่งของ สเต็มเซลล์
แท้จริงแล้วสเต็มเซลล์มีความสามารถในการสร้างเซลล์ชนิดต่างๆของร่างกาย แต่ทั้งนี้ต้องขึ้นอยู่กับชนิดของสเต็มเซลล์ และระยะของสเต็มเซลล์
การจำแนกชนิดของสเต็มเซลล์
Totipotent Stem Cell คือสเต็มเซลล์ที่มีศักยภาพสูงในการสร้างเซลล์ชนิดต่างๆทั้งร่างกาย พบได้ในระยะ Zygote
Pluripotent Stem Cell มีศักยภาพในการสร้างเซลล์ชนิดต่างๆได้น้อยกว่าระยะ Totipotent แต่ก็ยังสามารถสร้างเซลล์ต่างๆในร่างกายได้มากมาย พบได้ในระยะ Blastocyst หรือสามารถเรียกอีกอย่างว่า Embryonic Stem Cell
Multipotent Stem Cell มีศักยภาพในการสร้างเซลล์ลดลงน้อยกว่า pluripotent โดยมากมักแบ่งตัวเป็นเซลล์จำเพาะ พบได้ในเซลล์ชนิดต่างๆ หรืออาจเรียกว่า Adult Stem Cell
ความแตกต่างของ Stem Cell และ Progenitor Cell
สิ่งที่ใช้จำแนกลักษณะของเซลล์ 2 ชนิดนี้ คือ การแบ่งตัว โดยสเต็มเซลล์จะแบ่งตัวเป็น 2 ลักษณะดังนี้
1. การแบ่งตัวแบบ Symmetry คือ สเต็มเซลล์ 1 เซลล์จะแบ่งตัวออกออกให้เป็นสเต็มเซลล์อีก 2 เซลล์
2. การแบ่งตัวแบบ Asymmetry คือ สเต็มเซลล์ 1 ตัวจะแบ่งตัวออกเป็นสเต็มเซลล์ 1 เซลล์และเซลล์จำเพาะอีก 1 เซลล์
ในขณะที่ Progenitor Cell จะแบ่งตัวให้เป็นเซลล์จำเพาะทั้ง 2 เซลล์
ลักษณะพิเศษของ Embryonic Stem Cell (ESC)
1. Origin ได้มาจากช่วงก่อนหรือระหว่างการฝังตัวของ embryo
2. Self Renewal คือ เซลล์สามารถแบ่งตัวเองออกมาได้โดยที่ยังไม่ได้เปลี่ยนแปลงไปเป็นเซลล์ชนิดอื่นๆ
3. Pluripotency หมายถึง เมื่อนำเอา ESC ไปเพาะเลี้ยงจะสามารถแบ่งตัวได้ทั้ง 3 ชั้นของ embryonic germ layer
ลักษณะพิเศษของ Adult Stem Cell
1. Self Renewal คือ เซลล์สามารถแบ่งตัวเองออกมาได้อย่างต่อเนื่อง โดยที่ยังไม่ได้เปลี่ยนแปลงไปเป็นเซลล์ชนิดอื่นๆ
2. Remaining in the undifferentiated state หมายความว่า ไม่ว่าจะแบ่งตัวอย่างไร สเต็มเซลล์จะต้องมีส่วนที่เป็นสเต็มเซลล์คงเหลือไว้อยู่เช่นเดิม ยังเป็นเซลล์ที่ไม่ได้กลายเป็นเซลล์จำเพาะ
3. Differentiation potential to be a specialized cell หมายถึง มีความสามารถในการกลายเป็นเซลล์จำเพาะชนิดต่างๆได้
แหล่งของ Adult Stem Cell
โดยปกติแล้วสเต็มเซลล์มีอยู่เกือบทุกส่วนของร่างกายทั้งมนุษย์และสัตว์ ดังจะเห็นได้จากการซ่อมแซมอวัยวะต่างๆ ในร่างกาย เล็บที่งอกยาวขึ้น ผมที่ยาวได้ ล้วนเป็นผลมาจากสเต็มเซลล์ทั้งสิ้น แต่ในแต่ละแหล่งของ สเต็มเซลล์นั้นก็มีความแตกต่างในชนิดและปริมาณของสเต็มเซลล์ แหล่งที่พบสเต็มเซลล์ได้เป็นจำนวนมาก อาทิเช่น
- Cord blood - Skin
- Peripheral blood - Placenta and Umbilical cord
- Adipose tissue - Baby teeth
- Liver
Cord Blood
จัดว่าเป็นแหล่งของ Hematopoietic Stem Cell ที่สำคัญเพราะมีปริมาณที่สูง และมี T Cells ค่อนข้างน้อย จึงมีโอกาสเกิด GvHD (Graft versus Host Disease) ค่อนข้างต่ำ แต่ข้อเสียคือ มีปริมาณสเต็มเซลล์ที่จำกัด กรณีในคนการเก็บเลือดจากสายสะดือนี้จะทำการเก็บขณะคลอดทารก โดยสามารถเก็บได้ทั้งก่อนและหลังรกลอกตัว ปริมาณที่เก็บได้จะประมาณ 80-200 ml ทั้งนี้ขึ้นอยู่กับน้ำหนักทารก อายุครรภ์ เทคนิคการเจาะ และปัจจัยเสี่ยงอื่นๆ เช่น รกเกาะติดมดลูกต่ำ เป็นต้น
ข้อดีของการนำเลือดจากสายสะดือไปปลูกถ่ายก็คือ หากเป็นการปลูกถ่ายแบบ Allogeneic จะสามาถ miss match ของ HLA ได้ 2 ตำแหน่ง แต่ในกรณีจำเป็นการ miss match 3 ตำแหน่งก็อาจทำได้ โดยขึ้นอยู่กับดุลพินิจของแพทย์ นอกจากนี้เลือดจากสายสะดือนั้นไม่ได้มีแค่ Hematopoietic Stem Cell เท่านั้น ยังมีสเต็มเซลล์ชนิดอื่นๆ อีกด้วย เช่น Mesenchymal Stem Cell แต่มีปริมาณที่น้อยและประสิทธิผลในการ isolate ค่อนข้างต่ำ
รายละเอียดการเก็บเลือดจากสายรก
แม่ควรมีอายุมากกว่า 17 ปี
อายุครรภ์มากกว่า 36 สัปดาห์
ไม่มีประวัติการติดเชื้อไวรัส และโรคที่ติดต่อทางพันธุกรรม
เนื้อเยื่อของผนังมดลูกไม่มีการฉีกขาด หรือฉีกขาดไม่เกิน 24 ชั่วโมง
ไม่มีปัญหา, โรคแทรกซ้อนระหว่างการตั้งครรภ์
มีสัญญาณชีพ (Vital Sign) ที่ดี
ปากมดลูกขยายมากกว่า หรือเท่ากับ 7 เซนติเมตรเป็นอย่างน้อย
Peripheral Blood Stem Cell
เป็นการเก็บสเต็มเซลล์จากเส้นเลือดทั่วๆไป โดยฉีดยากระตุ้นให้เกิดการหลั่งของสเต็มเซลล์ออกมาจากไขกระดูกก่อน ที่เรียกว่า G-CSF (Granulocyte Colony Stimulating Factor) ซึ่งให้ประสิทธิภาพที่ดีกว่าการฉีด GM-CSF (Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor) โดยแพทย์จะฉีดให้ใต้ผิวหนัง (Subcutaneous) การแบ่งฉีด G-CSF เป็น 2 ครั้งต่อวันจะช่วยทำให้การหลั่งของสเต็มเซลล์มีมากขึ้น โดยจะฉีดเป็นเวลา 4 วันก่อนทำการเก็บด้วยเครื่อง Apheresis โดยปกติทั่วไปอาจต้องทำการเก็บ 2-3 วันเพื่อให้ได้ปริมาณสเต็มเซลล์ที่เพียงพอในการนำไปปลูกถ่าย
ข้อดีของการเก็บ Peripheral Blood Stem Cell นั้นคือ จะสามารถเก็บปริมาณสเต็มเซลล์ได้เท่าที่แพทย์ต้องการ แต่ก็อาจพบว่ามี T cell ที่มีปริมาณมากกว่า Cord Blood นอกจากนี้แล้วการนำไปปลูกถ่ายจะต้องมี HLA ที่ตรงกันทั้ง 6 ตำแหน่ง แต่การฉีด G-CSF นั้นก็มีข้อควรระวัง คือ หากพบว่าเม็ดเลือดขาว (WBC) เพิ่มสูงมากกว่า 35 × 10 9L. ให้พิจารณาลดขนาดยาลง แต่หากสูงมากกว่า 50 × 109L. แนะนำให้หยุดฉีด
Adipose Tissue
เป็นแหล่งของ Mesenchymal Stem Cell (MSC) ที่น่าสนใจเนื่องจากมีปริมาณของสเต็มเซลล์มาก คือประมาณ 5 % จึงไม่มีความจำเป็นที่ต้องนำไปเพิ่มจำนวน การแยกสเต็มเซลล์จากเซลล์ไขมันจะใช้หลักการย่อยเซลล์อื่นด้วยเอนไซม์ จากนั้นนำไปล้างและปั่นแยกเก็บด้วยเครื่อง Centrifuge
Mesenchymal Stem Cell ศักยภาพจะอยู่เหนือระหว่างชั้น Ectoderm และ Mesoderm ดังนั้นจะพบได้ว่ามีการนำ MSC ไปทดลองรักษาในผู้ป่วยที่เป็นโรคทางระบบประสาท (สร้างมาจากชั้น Ectoderm) ได้ นอกจากนี้แล้วยังมีการพัฒนาใช้ MSC ไปรักษาเซลล์ที่สร้างจากชั้น Mesoderm เช่น กระดูก ข้อ เอ็น หลอดเลือด หัวใจ นอกจากนี้การใช้ MSC ร่วมกับ HSC จะช่วยลดการเกิด GvHD ลงได้ทั้งแบบ Chronic และ Acute รวมถึงเพิ่มประสิทธิผลในการสร้างเซลล์เม็ดเลือดได้ดียิ่งขึ้น
Baby Teeth
เป็นแหล่งของ MSC เช่นกัน โดยพบว่า มีฟันน้ำนมเพียง 6 ซี่หน้า และฟันคุด เท่านั้นที่มีสเต็มเซลล์อยู่ การแยกสเต็มเซลล์จากฟันน้ำนมนี้จะต้องแยกภายใน 48-72 ชั่วโมงหลังจากฟันหลุด ในกรณีที่ไม่มีชุดเก็บฟันน้ำนม สามารถแช่ในนมจืด และจัดเก็บที่อุณหภูมิ 4 °C เพื่อทำการส่งไปแยกที่ห้องปฏิบัติการณ์ได้ หลักการแยกจะใช้หลักการคล้ายกับ Adipose tissue คือ การสลายส่วนที่เป็น Bone ออก จะพบโพรงรากฟันซึ่งมีเซลล์ประสาท หลังจากนั้นแยกเซลล์ประสาทออกและนำไปเพาะเลี้ยงสเต็มเซลล์ในอาหารเลี้ยงเชื้อพิเศษ เนื่องจากว่า MSC ในฟันนั้นมีปริมาณที่น้อยมากจึงจำเป็นที่จะต้องเพิ่มจำนวนให้มากพอก่อนที่จะทำการเก็บรักษาสเต็มเซลล์เหล่านี้ในถังไนโตรเจนเหลว
สเต็มเซลล์จากแหล่งอื่นๆ
เช่น ตับในทารก, ผิวหนัง, สายรก (Cord),น้ำคร่ำ และ Whartons jelly ล้วนเป็นเรื่องที่น่าสนใจ ตัวอย่างเช่นมีการนำเอาสเต็มเซลล์จากผิวหนังไปเลี้ยงให้เป็นเซลล์กระจกตา หรือการนำไปรักษาผู้ป่วยที่มีเส้นเสียง (Vocal fold) ที่ผิดปกติในคนที่เสียงแหบ เป็นต้น
การใช้ Marker ในการหาแหล่งสเต็มเซลล์
สเต็มเซลล์ไม่ได้มีมากมายเหมือนเซลล์ทั่วไป เราอาจพบสเต็มเซลล์เพียง 1 เซลล์ใน 100,000 เซลล์ทั่วไป ดังนั้นนักวิทยาศาสตร์จึงจำเป็นต้องหาวิธีการในการจับสเต็มเซลล์ นั่นก็คือการใช้ Marker โดย Marker นี้จะไปทำการเคลือบผิวของเซลล์ที่มีลักษณะโปรตีนที่จำเพาะ หรือที่เราเรียกว่า Receptor ซึ่งจะมีความสามารถในการเลือกจับหรือยึดเกาะติดกับโมเลกุลเซลล์ที่ปล่อยสัญญานที่จำเพาะออกมา ดังนั้นหากเราเลือก Marker ที่จำเพาะต่อเซลล์ชนิดที่เราต้องการก็ย่อมที่จะแยกความแตกต่างในส่วนของสัญญานที่แตกต่างกัน จึงทำให้เราแยกชนิดของเซลล์ได้นั่นเอง แต่โดยมากแล้วไม่จำเป็นว่า เซลล์ชนิดนี้จะต้องจับกับ Marker ตัวนี้ตัวเดียวเท่านั้น ตัวอย่างเช่น เราใช้ CD34+ เป็น Marker ของ HSC แต่แท้ที่จริงนั้น ในส่วนของกลุ่ม CD34+ ที่เราจับได้นั้นมีหมายถึงว่าในนั้นมี HSC ปรากฎรวมอยู่ด้วย ไม่ใช่ว่า CD34+ ทั้งหมดนั้นเป็น HSC
ชนิดของ Marker
1. Fluorescent Tags
การใช้ Fluorescent tags ซึ่งจะไปจับกับ Cell receptor ที่ผนังของสเต็มเซลล์ที่จำเพาะต่อ Marker ชนิดนี้ ซึ่งจะพบการเรืองแสงของ Tag หรือไม่ก็ได้ หากเกิดการเรืองแสงเราก็จะใช้สัญลักษณ์ + แต่หากไม่พบการเรืองแสงก็จะใช้สัญลักษณ์ -
2. Fluorescent-activated cell sorting (FACS)
เป็นการใช้เครื่อง Flow Cytometry ช่วยในการจำแนก โดยใช้หลักการของ Cell size และ Granularity ที่มีความแตกต่างกัน สามารถตรวจนับหรือวัดลักษณะจำเพาะของ particle และ เซลล์ได้ นอกจากนี้ยังสามารถใส่สารเรืองแสง เช่น Fluorescence or immuno-fluorescence เพื่อเป็น Surface marker และ Intracellular markers
* Fluidic system มีหน้าที่ในการสร้างกระแสการไหลของ Fluid หรือ Isotonic buffer saline solution ที่มีเซลล์ หรือ Particles ที่ต้องการตรวจนับเป็นแขวนลอยอยู่ และมีตัวบังคับให้เซลล์ไหลเรียงเดี่ยว ด้วยความเร็วที่เท่าๆ กันให้ผ่าน Flow chamber ซึ่งมีตัวปล่อยแสง Laser ส่องมากระทบเซลล์ที่ไหลผ่าน
* Optical system ทำหน้าที่สร้างลำแสง ซึ่งส่วนมากเป็นแสง Laser เนื่องจากเป็น monochromatic และ high intensity เมื่อลำแสงส่องกระทบเซลล์ที่ตกลงใน Flow chamber ก็จะเกิดการหักเหของแสง 2 แบบ คือ Forward scatter (low angle) ซึ่งจะแปรผันตามขนาดของเซลล์ และเกิดการหักเหแบบ Side scatter (high angle) ซึ่งจะแปรผันตาม granularity ของเซลล์นั้นๆ นอกจากนี้หากทำการย้อมสีก็จะพบการเรืองแสงตามชนิดของ dye นั้นๆออกมาทาง side scatter อีกด้วย
* Detector system มีหน้าที่ตรวจรับสัญญาณแสงทั้ง 2 ชนิดที่ออกมารวมทั้ง Fluorescent signal โดยมี photo-multiplier tube หรือ light detectors ทำหน้าที่รับสัญญาณแสงแล้วแปลงเป็นสัญญาณไฟฟ้า โดยจะมีตัว detector อย่างน้อย 4 ตัว (4 Channels) โดยมีสำหรับ forward scatter และside scatter อย่างละ1 ตัว อีก 2 ตัวที่เหลือสำหรับ fluorescent สีเขียว (ที่ 525 nm ของ fluorescein isothiocyanate,FITC) และสีแดง (ที่ 575 nm ของ rhodamine phycorrythrin,RPE) อย่างละ 1 ตัว แต่สำหรับเครื่องที่มีประสิทธิภาพสูงจะมี Detector เพิ่มขึ้นอีก 2 ตัวสำหรับความยาวคลื่นแสงที่ 620 nm และ 675 nm รวมแล้วสามารถรับสัญญาณ Fluorescence ได้ทั้งหมด 4 channels
* Data process system มีหน้าที่รวบรวมสัญญาณไฟฟ้าที่ได้รับมาจาก detector system แล้วนำไปประมวลผล เรียบเรียงให้เป็น histogram ซึ่งทั้งหมดนี้จะเป็นการทำงานของระบบคอมพิวเตอร์แล้วแสดงออกมาที่หน้าจอหรือพิมพ์ออกมาในกระดาษได้
3. Microscopic Image of Fluorescent-Label Stem cell
คือ การใส่ Reporter gene ที่เรียกว่า Green fluorescent protein or GFP เข้าไปในสเต็มเซลล์ โดยเซลล์ที่ยังไม่มีการเปลี่ยนแปลง (differentiate) จะติดสีและเรืองแสงออกมา ในขณะที่สเต็มเซลล์ที่มีเปลี่ยนแปลงไปเป็นเซลล์จำเพาะอื่นๆแล้วจะไม่แสดง signal หรือเรืองแสงให้เห็น
หน้าที่ของ Regenerative Cell
1. Homing หมายถึง สเต็มเซลล์จะมีการวิ่งไปยังตำแหน่งที่มีความเสียหาย หรือมีการอักเสบเกิดขึ้นได้เองโดยทันที
2. Differentiation หมายถึง สเต็มเซลล์สามารถเปลี่ยนแปลงตัวเองให้เป็นเซลล์ที่จำเพาะต่อบริเวณที่มีความเสียหายเกิดขึ้นได้
3. Trophic support หมายถึง เซลล์จะทำการหลั่งสารจำพวก Cytokine และ Growth factor ชนิดต่างๆออกมาเพื่อให้เกิด tissue regenerative
4. Anti-inflammation หมายถึง เซลล์ที่เข้าไปจะต้องสามารถลดการเกิดการอักเสบที่เกิดขึ้นได้
5. Neo-vascularization หมายถึง เซลล์จะต้องหลั่ง Growth factor ที่สำคัญออกมาเพื่อช่วยให้เกิดการสร้งหลอดเลือดใหม่ขึ้น และแก้ไขปัญหาในเรื่องของ Scar tissue ได้
6. Anti-apoptosis หมายถึง เซลล์จะต้องลดการตายของเซลล์บริเวณที่เกิดปัญหาขึ้นได้
ปัจจัยที่มีผลต่อการเก็บและการใช้สเต็มเซลล์ในการปลูกถ่ายรักษาโรค
อายุ
ไม่ว่าจะคนหรือสัตว์เราจะพบว่าคนที่มีอายุมากขึ้นจะพบว่ามีปริมาณสเต็มเซลล์ลดลง รวมถึงเปอร์เซนต์การประสบความสำเร็จในการปลูกถ่ายที่ลดลง ในคนที่อายุมากกว่า 65 ปีขึ้นไปก็จะไม่แนะนำให้ทำการเก็บสเต็มเซลล์หากไม่จำเป็น
นอกจากนี้ ในสัตว์* เราพบว่าสัตว์ที่มีอายุมากแล้ว เปอร์เซนต์การรักษาหายจะลดลงเหลือประมาณ 58 % เมื่อเทียบกับสัตว์ที่มีอายุน้อยซึ่งจะให้ผลการรักษาหายสูงถึง 91 %
*เป็นการทดลองรักษาโรคเอ็นอักเสบในม้าของ บริษัท Vet-Stem,USA.
ตำแหน่งที่รักษา
ตำแหน่งของรอยโรคที่มีปัญหาก็สามารถที่จะให้ผลการรักษาที่แตกต่างกัน นอกจากนี้การเลือกตำแหน่งที่ฉีดสเต็มเซลล์ก็อาจมีผลลดอัตราการรักษาหายลงได้เช่นกัน ทั้งนี้คงต้องมีการทดลองต่อไป
เผ่าพันธุ์
ในคนยังไม่มีการทดลองจุดนี้ แต่ในสัตว์พบว่าสายพันธุ์ให้ผลในการรักษาที่แตกต่างกัน เช่นในการรักษาเอ็นอักเสบในม้าพบว่า ม้าสายพันธุ์อังกฤษให้ผลการรักษา 63% เมื่อเทีบกับม้าสายพันธุ์ Western ที่ให้ผลการรักษา 87%
ปริมาณโดสเต็มเซลล์ที่ใช้ในการรักษา
ทั้งนี้ต้องเลือกชนิดของสเต็มเซลล์ที่จะนำมาปลูกถ่าย เพราะแต่ละแหล่งอาจใช้โดสในการปลูกถ่ายที่แตกต่างกัน เช่น การใช้ Cord blood จะใช้โดสต่ำกว่าการปลูกถ่ายด้วยไขกระดูก และหากสามารถปลูกถ่ายสเต็มเซลล์โดยให้โดสที่สูงกว่าค่าที่กำหนด ก็จะทำให้ระยะเวลาในการสร้างเซลล์มีโอกาสที่ลดลงได้ นอกจากนี้ชนิดของโดสที่จะเลือกใช้อาจดูจากจำนวนของ marker ที่ใช้วัด หรือดูจากจำนวนของ mononuclear cell ก็ได้ซึ่งจะใช้โดสในการปลูกถ่ายที่แตกต่างกัน
การดูแลรักษาตัวเอง
เป็นสิ่งที่สำคัญมากเพราะการรักษาด้วยสเต็มเซลล์นั้นไม่ได้รวดเร็วเหมือนการใช้ยารักษาโรคที่จะเห็นผลได้เร็วกว่า รวมถึงการที่สเต็มเซลล์มีคุณสมบัติของการ Homing ดังนั้นหากผู้ป่วยมีปัญหา 2 จุด อาจส่งผลให้สเต็มเซลล์แยกกันออกไปรักษา จึงทำให้ประสิทธิภาพการรักษาด้อยลงไป นอกจากนี้หากเป็นการใช้สเต็มเซลล์แบบ Allogeneic จะต้องได้รับการดูแลอย่างใกล้ชิด เพื่อป้องการการ reject ของเซลล์ และจะต้องได้รับยาเพื่อกดภูมิคุ้มกัน หรืออาจต้องได้รับยาป้องกันการติดเชื้อและ Supportive treatment ต่างๆร่วมด้วย
การเลือกใช้ชนิดของ Adult stem cell
ไม่ใช่ว่าสเต็มเซลล์จะรักษาหรือสร้างเซลล์ได้ทุกชนิด แต่อยู่ที่การเลือกชนิดของสเต็มเซลล์ในการรักษา เช่นหากต้องการสร้างเม็ดเลือดก็ต้องใช้ HSC หากต้องการสร้างกระดูกก็ต้องใช้ MSC ดังนั้นให้ดูว่าเซลล์ที่เราจะมาทำการรักษาอยู่ที่ embryonic germ layers ในชั้นใด
โรคที่ใช้ Adult Stem Cell ในการรักษา
Cardiovascular diseases
CNS & Spinal cord injury
Organ failures
Blood diseases
Certain genetic disorders
Autoimmune diseases
Osteoartritis, Tendons ,Fracture
เอกสารอ้างอิง
1. ยุทธนา หมั่นดี.Flow Cytometry.ประชุมวิชาการประจำปี 2549 คณะเทคนิคการแพทย์
มหาวิทยาลัยเชียงใหม่ : 160-162
| Create Date : 03 มิถุนายน 2550 | | |
| Last Update : 3 มิถุนายน 2550 18:58:59 น. |
| Counter : 2234 Pageviews. |
| |
|
 |
|
ฝากข้อความหลังไมค์
Rss Feed
ผู้ติดตามบล็อก : 4 คน [