พล.อ.ประยุทธ์ จันทร์โอชา รับราชการทหารอยู่ที่กรมทหารราบที่ 21 รักษาพระองค์ (ทหารเสือราชีนี) โดยเริ่มจากตำแหน่งผู้บังคับการกองพัน ถึงผู้บังคับการกรม จากนั้นจึงย้ายไปอยู่ที่กองพลทหารราบที่ 2 รักษาพระองค์ และรับตำแหน่งรองแม่ทัพภาคที่ 1

ต่อมาเมื่อเกิดเหตุการณ์รัฐประหาร นำโดยคณะปฏิรูปการปกครองในระบอบประชาธิปไตยอันมีพระมหากษัตริย์ทรงเป็นประมุข (คปค.) เมื่อวันที่ 19 กันยายน พ.ศ. 2549 ซึ่งมี พล.อ.สนธิ บุญยรัตกลิน เป็นหัวหน้าคณะ พล.อ.ประยุทธ์ จันทร์โอชา ขณะนั้นมียศเป็น "พลตรี" ก็เป็นผู้มีบทบาทสำคัญในการยึดอำนาจ โดยรับคำสั่งตรงจาก พล.ท. อนุพงษ์ เผ่าจินดา แม่ทัพภาคที่ 1 จากนั้นเมื่อ พล.ท. อนุพงษ์ ได้รับแต่งตั้งให้เป็นผู้ช่วยผู้บัญชาการทหารบกและเลื่อนชั้นยศเป็น "พลเอก" พล.ต.ประยุทธ์ จันทร์โอชา ก็ได้เลื่อนยศขึ้นเป็น "พลโท" และรับตำแหน่งแม่ทัพภาคที่ 1 และได้รับแต่งตั้งให้เป็นสมาชิกสภานิติบัญญัติแห่งชาติจากคณะมนตรีความมั่นคงแห่งชาติ (คมช.) ด้วย

พล.อ. ประยุทธ์ จันทร์โอชา เป็นรองหัวหน้าผู้รับผิดชอบในการแก้ไขสถานการณ์ฉุกเฉิน เมื่อวันที่ 2-14 กันยายน 2551 และรับตำแหน่งรองผู้อำนวยการกองอำนวยการแก้ไขสถานการณ์ฉุกเฉิน

พล.อ.ประยุทธ์ จันทร์โอชา ได้รับแต่งตั้งให้เป็นผู้บัญชาการทหารบก เมื่อวันที่ 2 กันยายน พ.ศ. 2553  และนายอภิสิทธิ์ เวชชาชีวะ นายกรัฐมนตรีในขณะนั้น ได้แต่งตั้งให้ พล.อ.ประยุทธ์ จันทร์โอชา เป็นหัวหน้าผู้รับผิดชอบในการแก้ไขสถานการณ์ฉุกเฉิน ตั้งแต่วันที่ 1 ตุลาคม พ.ศ. 2553 ถึง 22 ธันวาคม พ.ศ. 2554 และเป็นหนึ่งในคณะดำเนินคดีศาลยุติธรรมระหว่างประเทศระหว่างประเทศไทยและกัมพูชา พ.ศ. 2554

พล.อ.ประยุทธ์ จันทร์โอชา เป็นผู้อำนวยการรักษาความสงบเรียบร้อย (ผอ.รส.) ในการประกาศกฎอัยการศึกทั่วราชอาณาจักร เมื่อวันที่ 20 พฤษภาคม พ.ศ. 2557 เป็นผู้นำรัฐประหารในนามคณะรักษาความสงบแห่งชาติ (คสช.) เมื่อวันที่ 22 พฤษภาคม พ.ศ. 2557