ขั้นตอนการตรวจสอบลายพิมพ์ดีเอ็นเอ

          1. เตรียมตัวอย่างเลือด 5 ซีซี หรือตัวอย่างขนพร้อมรากอย่างน้อย 20 เส้น หรือน้ำเชื้อแช่แข็ง 1 หลอด 

          2. สกัดดีเอ็นเอจากเลือด: ดีเอ็นเอของเม็ดเลือดขาวอยู่ในนิวเคลียส นำมาสกัดได้โดยกรทำลายเยื่อหุ้มเซลล์เม็ดเลือดขาวด้วยสารละลายโซเดียมโดเดซิลเฟต (sodium dodecyl sulphate, SDS) แล้วย่อยโปรตีนต่าง ๆ ด้วยเอ็นไซม์โปรตีนเนสเค (proteinase K) จากนั้นจึงตกตะกอนโปรตีนด้วยสารละลายฟีนอลและคลอโรฟอร์ม แล้วตกตะกอนดีเอ็นเอซึ่งอยู่ในชั้นน้ำด้วยเอธานอล เนื่องจากฟีนอลเป็นสารที่เป็นอันตรายต่อผิวหนังและเยื่อบุ จึงอาจใช้สารละลายอิ่มตัวโซเดียมคลอไรด์ตกตะกอนโปรตีนได้ ซึ่งจะงาย ประหยัดเวลา และปลอดภัยสำหรับผู้ปฏิบัติงาน 

          3. การสกัดดีเอ็นเอจากน้ำเชื้อ: ดีเอ็นเออยู่ที่ส่วนหัวของอสุจิ ต้องสกัดโปรตีนที่อยู่ในส่วนหัวด้วยสารละลาย ไดไธโอธรีอิทอล (dithiothreitol) จากนั้นจึงย่อยโปรตีนด้วยเอ็นไซม์โปรตีนเนสเค และขั้นตอนอื่น ๆ เหมือนการสกัดดีเอ็นเอจากเม็ดเลือดขาว 

          4. เพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมในหลอดทดลองด้วยเทคนิคพีซีอาร์ คือเทคนิคที่มีการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอ โดยอาศัยเอ็นไซม์ดีเอ็นเอโพลีเมอเรส ทำให้ได้ปริมาณเพิ่มขึ้นเป็นล้านเท่าภายในระยะเวลาเพียง 2-3 ชั่วโมง นักวิทยาศาสตร์ชาวอเมริกัน ชื่อ ดร. มัลลิส (KB. Mullis) และคณะเป็นผู้คิดค้น ปฏิกิริยาพีซีอาร์ประกอบด้วย 

          5. ช่วงอุณหภูมิ 90-95 องศาเซลเซียส เป็นอุณหภูมิที่ทำให้ดีเอ็นเอต้นแบบแยกตัวออกจากเส้นคู่ เป็นเส้นเดี่ยว 

          6. ช่วงอุณหภูมิ 50-60 องศาเซลเซียส เป็นอุณหภูมิที่ใช้ในการจับคู่กันระหว่างดีเอ็นเอเส้นเดี่ยวและไพรเมอร์ขนาด 20-30 เบสที่มีลำดับคู่เบสคู่สมกับลำดับเบสในดีเอ็นเอต้นแบบเข้ามาจับดีเอ็นเอสายเดี่ยวทั้ง 2 เส้น 

          7. ช่วงอุณหภูมิ 70-72 องศาเซลเซียส เป็นอุณหภูมิสำหรับเอ็นไซม์ดีเอ็นเอ โพลีเมอเรส ซึ่งทำหน้าที่เร่งปฎิกิริยาการเติมเบสของดีเอ็นเอเส่นเดี่ยวที่ ปลาย 3 

          เมื่อเริ่มต้นจากดีเอ็นเอต้นแบบ 1 คู่ เกิดปฏิกิริยาตั้งแต่ข้อ (1) จนถึงข้อ (3) ดำเนินไปจนสิ้นสุดรอบ 1 จะได้ดีเอ็นเอเส้นคู่ชุดใหม่จำนวน 2 ชุด ในปฏิกิริยารอบที่ 2 ดีเอ็นเอเส้นคู่ 2 ชุดนี้จะแยกป๋นดีเอ็นเอเส้นเดี่ยว 4 เส้น เพื่อทำหน้าที่เป็นดีเอ็นเอต้นแบบ เมื่อสิ้นสุดปฏิกิริยารอบที่ 2 นี้จะได้ดีเอ็นเอชุดใหม่ จำนวน 4 คู่ และเมื่อเริ่มปฏิกิริยารอบที่ 3 จะได้ดีเอ็นเอชุดใหม่จำนวน 8 คู่ โดยที่สิ้นสุดปฏิกิริยาในแตละรอบจะได้จำนวนของดีเอ็นเอต้นแบบเข้าสู่ปฏิกิริยาเพิ่มขึ้น จึงได้ดีเอ็นเอที่ต้องการเพิ่มขึ้น ลักษณะการเพิ่มจำนวนดีเอ็นเอของปฏิกิริยาเป็นการเพิ่มแบบทวีคูณ คือ 2 n (เมื่อ n เป็นจำนวนรอบของปฏิกิริยา) ดังนั้นเมื่อปฏิกิริยาดำเนินไปได้ 25 รอบ จะได้ดีเอ็นเอชุดใหม่จำนวน 225 ชุดหรือประมาณ 34 ล้านเท่าของปริมาณดีเอ็นเอต้นแบบ 

          แยกขนาดของสารพันธุกรรมต่าง ๆ ที่ได้ การทำไฮบริไดเซชั่น: กระบวนการทำไฮบริไดเซชั่น เป็นการจับคู่กันด้วยพันธะไฮโดรเจนระหว่างดีเอ็นเอตรวจสอบซึ่งมีลำดับเบสคู่กับลำดับเบสบนดีเอ็นเอเป้าหมายที่แยกออกเป็นเส้นเดี่ยว โดยเริ่มต้นจากการย้ายดีเอ็นเอจากแผ่นวุ้นไปยังแผ่นเยื่อไนลอน โดยการแช่แผ่นวุ้นโดยสารละลายด่าง เพื่อแยกดีเอ็นเอสายคู่เป็นสายเดี่ยว แล้วย้ายดีเอ็นเอด้วยการดูดซับน้ำ โดยสารละลายจากด้านล่างของวุ้นจะผ่านซึมแผ่นวุ้น และแผ่นเยื่อพิเศษไปยังกระดาษกรองที่แห้งด้านบนการดูดซับทำให้ดีเอ็นเอเคลื่อนที่จากแผ่นวุ้นไปจับอยู่บนแผ่นเยื่อพิเศษ จากนั้นจึงทำไฮบริไดเซชั่น ด้วยดีเอ็นเอตรวจสอบ ซึ่งสามารถติดฉลากด้วยสารรังสี เช่น (?-32P) dNTP หรือสารปลอดรังสีเช่น dUTP ที่ติดฉลากด้วยสารดิกอกซิเจนิน (digoxigenin-dUPT) แล้วจึงตรวจสอบ ลายพิมพ์ดีเอ็นเอโดยประกอบด้วยแผ่นฟิล์มเอ็กซเรย์หรือโดยการย้อมสี 

          การแยกผลผลิตพีซีอาร์ที่ได้จากส่วนที่เป็นไมโครแซทเทลไลท์ โดยใช้ตัวกลางชนิดโพลีอะคริลาไมด์ (polyacrylamide gel) ซึ่งเป็นตัวกลางที่มีความเข้มข้น 4-6% เพราะในการแยกดีเอ็นเอที่มีความแตกต่างของเบสเพียง 1 เบสได้ โดยใช้ตัวกลางมี ผ่านกระแสไฟฟ้าขนาด 40 วัตต์ นาน 45-60 นาที การตรวจสอบแถบดีเอ็นเอที่เกิดขึ้นได้หลายวิธีเช่น การใช้รังสีสารฟลูออเรสเซนซ์ (fluorescence) และการย้อมด้วยสารละลายซิลเวอร์ ซึ่งเป็นสารเคมีที่มีความไวสูงมากในการตรวจสอบดีเอ็นเอ มีข้อดีที่สามารถอ่านผลได้ด้วยตาเปล่า ในขณะที่การใช้ ฟลูออเรสเซนซ์ ใช้เครื่องมือ Automate Genetic Sequencer เป็นเครื่องอ่าน สำหรับการแยกผลผลิตพีซีอาร์ที่ได้จากส่วนมินิแซทเทลไลท์ เช่น โลกัส DIS80 ด้วยเทคนิคพีซีอาร์นั้นจะได้ผลผลิตพีซีอาร์เป็นแถบดีเอ็นเอจำนวน 2 แถบต่อหนึ่งโลกัส เรียกแถบดีเอ็ยเอแต่ละแถบว่า “อัลลีล” ดังนั้นในแต่ละโลกัสจะแสดงจีโนไทป์ที่ประกอบด้วย อัลลีล 2 อัลลีล ตัวอย่างจีโนไทป์แบบ ไฮเทอโรไซกัส DIS80

การตรวจสอบดีเอ็นเอ 

         1. ทำปฏิกิริยาเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมในหลอดทดลองเพื่อศึกษาตำแหน่ง ของเครื่องหมายพันธุศาสตร์ 11 ตำแหน่ง 

         2. ใช้เครื่องมือ  Automate Genetic Analyzer ในการแยกขนาดสารพันธุกรรม 

         3. ใช้คอมพิวเตอร์ (โปรแกรมพิเศษ) ในการวิเคราะห์ผล

Create Date : 12 กุมภาพันธ์ 2553
Last Update : 12 กุมภาพันธ์ 2553 0:06:46 น.		0 comments
Counter : 2909 Pageviews.
Share Tweet