Group Blog
 
All Blogs
 

Anomalous diffraction (scattering or dispersion) SAD, MAD Phasing in Protein Crystallography

ผ่านไปอีกเกือบ 2 ปีเลยทีเดียวจาก blog ครั้งที่แล้ว แต่จริงๆถือว่าผ่านไป 4 กว่าเลยด้วยซ้ำตั้งแต่ เริ่มต้นทำ blog เรื่อง Protein crystallography ขึ้นมา

ก่อนจะร่ายยาว ผมขอบอกก่อนว่า ผมจะพูดเกี่ยวกับ phasing โดย anomalous scattering เพียงแค่หลักการเท่านั้นนะครับ สำหรับ คณิศาสตร์ และ ฟิสิกส์ขอละเอาไว้ ถ้าสงสัยขอให้ติดต่อถามมาเป็นการส่วนตัวเหมือนที่ตลอด 2 ปีที่ผานมา ก็ได้รับเกียรติจากหลายๆท่านติดต่อเข้ามาพูดคุยแลกเปลี่ยนกันพอสนุกสนาน :)

เมือเราได้ crsytal แล้วใช่ไหมครับ เราเอามันไปยิงกับ x-ray เราจะได้ จุดดำๆบน detector ซึ่งจุดดำๆก็คือคลื่นแสงที่สะท้อนมาจาก electron บน protein นันเอง ถ้าเราสามารถคลำทางจากจุดดำแล้วไล่ไปตามแนวแสงจนไปถึงต้นตอที่เกิดการสะท้อน ตรงนั้นเองเราจะเห็นว่า อ่อ electron ตัวที่สะท้อนกับเส้นแสงเส้นนี้อยู่นี่เอง คลำทางแบบนี้ไปเรื่อยก็จะเจอ electron มากขึนๆ จนในที่สุดก้เจอเยอะพอที่จะทำให้เห็นภาพใหญ่ภาพรวมว่ามันมีหน้าตาเป็นอย่างไร ซึ่งก็เป็นหน้าตาของ protein นั้นเอง (เราถือว่าผิวชั้นนอกสุดของ atom คือ electron ฉันใดฉันนั้น ผิวหนังเราชั้นนอกสุดในระดับ atom ก็คือ electron แปลว่าเราเห็นหน้าตากันว่าสวยหล่อก็คือเรามองไปที่หนังหน้าซึ่งมันสร้างมาจาก electron นั่นเอง 555)

การคลำทางจากเส้นแสง มันเป็นคลื่นใช่ไหมครับ ดังัน้นถ้าจะเดินทางแบบแสง เราก็ต้องเป็นคลื่น ซึ่งจะเป็นคลื่นได้ เราต้องมี amplitude และ phase !!! amplitude เราได้แล้วจากการวัดความเข้มแสงซึ่งก็คือจุดดำ ยิ่งดำมาก ดำเป็นวงกว้างมากแปลว่ามี photon มาก amplitude ทราบ! แต่ phase ซึ่งเป็นตัวอ้่างอิงตำแหน่งของคลื่นเราวัดออกมาไม่ได้ครับ และนีคือ phase problem ใน protein crystallography นี่แหละครับ

ในที่นี้ผมจะพูดเกี่ยวกับเทคนิดการหา phase ของคลื่นใน crsytollography โดยเทคนิดนี้ชื่อว่า anomalous scattering ครับ

ปกติ เมื่อแสง x-ray ยิงเข้าไปชน electron ถ้าพลังงาน x-ray ไม่พอดีกับ electron, electron มันก็จะไม่ดูดพลังงา่นจาก photon ของ x-ray light, ดังนั้น x-ray มาชน electron แล้วเด้งออกไปเลยด้วยยังมี phase เหมือนเดิมกับเมื่อตอนก่อนที่จะชนกับ electron

แต่ถ้า x-ray มีพลังงานพอดีกับ electron, electron ก็จะดูดพลังงานจาก x-ray ได้ ทำให้ x-ray เป็นง่อยครับ คือแทนที่จะกระเด้งออกไปทันทีแต่กลับถูก delay จากการ absorption ทำให้เมื่อกระเด้ง (diffract หรือ scatter) ออกมาแล้ว ทำให้ phase เปลี่ยนแปลงไป ทำให้ไม่เท่ากับกับ phase ของ x-ray เมื่อตอนก่อนที่จะเกิดการชน การกระเจิงหรือจะกระเด้งของแสงแบบนี้เรียกว่าเป็นการกระเจิงแบบ anomalous (ไม่สมดุล, ไม่ปกติ) ครับ

วิธีเอาธรรมชาติข้อนี้ของ atom มาใช้่งานในงาน protein cryatallography

ปกติเราจะ label โปรตีนตัว heavy atom (HA) เพราะ HA จะมีพฤิกรรม anomalous ชัดเจนกว่าอะตอมเล็กๆ ที่นิยมคือ เราจะทำการ express protein ด้วย bacteria ที่เลี้ยงในอาหารที่มี selenomethionine โดย protein ในส่วน methonine ของมันจะมี Selenium แปะอยู่แทนที่ sulpher อะตอม


ทีนี้เมือเรายิง x-ray เข้ไปใน crystal ของ protein ทีมี Se เป็นองค์ประกอบ โดยจะปรับพลังงา่น x-ray ให้เหมา่ะสมกับพลังงาน electron บน selenium เพื่อล่อให้มันกระเจิงแบบ anomalous แสง x-ray ส่วนหนึ่งจะถูก absorbed และกระเิจิงแบบ anomalous

ดังัน้นแสงที่กระเด็นออกไปแบบ anomaous เราจะถือว่ามันประกอบด้วย การกระเจิงแบบปกติ กับ แบบ anomalous ผสมกันมา (หมายความว่า ถ้าไม่เกิด anomalous แสงที่กระเจิงออกมา ก็จะมีแต่ส่วนของการกระเจิงแบบปกติ)

อ่ะ ดูรูปครับ





ดังนั้น Fpha ก็คือ total vector ที่เกิดจาก Fph (กระเจิงปกติ หรือจากโปรตีน รู้นะว่างง เอาเป็นว่า ถ้า electron มันไม่ anomalous มันก็จะกระเจิงแบบปกติ ซึ่งก็หมายถึงโปรตีนที่ไม่ควรจะมี HA นั้นเองที่ไม่) กับ vector ที่เิกิดจาก anomalous effect (f' และ f'')

อ่านต่อในรูปต่อไปครับ






อย่าลืมนะครับว่า เราจะสร้างรูปจากสมการที่ 1 ได้ เราต้องทราบ magnitude และ phase ของ f' และ f'' ก่อนเราถึงจะ fix มันลงไปใน diagram ได้ ส่วน magnitude ของ Fpha เราวัดได้ครับ เพราะเป็นผลการทดลองยิง x-ray ที่ได้นั่นเอง

magnitude ของ f' และ f'' เป็นค่าคงที่ของ HA ณ ความยาวคลื่นของ x-ray หนึ่งครับ ซึ่งเราสามารถเปิดดูได้จากตารางครับ ประมาณตารางธาตนั่นแหละครับ (ปกติในการทดลองจริงๆ เราจะทำการ scan โดยการยิง x-xray ด้วยความยาวคลื่นค่าต่างๆเพื่อกำหนดหา f'และ f'' ที่เหมาะสม (ซึ่งก็ทำให้เราทราบค่า f' และ f'' โดยปริยาย ซึ่งก็รู้แค่ magnitude ครับไม่รู้ phase)

ปัญหาคือ เราจะรู้ phase ของ f'และ f'' ได้ยัง คือตอบอยู่ที่ Patterson map ครับเพื่อจะทำการควานหาตำแหน่งหรือ coordinate ของ HA ซึ่งจะทำให้ทราบ phase ของ f' และ f'' เพื่อเอาไปวาดรูปของสมการ (1) ได้

แต่ สมการ (1) ก็ให้คำตอบ 2 ค่าซึ่งไม่รู้ว่าคืออะไรตัวไหน จำเป็นจะต้องสร้างสมการอีก 1 สมการเพื่อหาทางแก้เอาตัวแปล Hph ออกมาให้ได้

เมื่อรู้ Fph ได้ ซึ่งภายหลังต่อไปเมือ่เราทราบ coordinate (รู้ทั้ง magnitude และ phase) ของ HA เราก็สามารถเอาไปปรับทอนออกจากจาก Fph ให้เป็นแค่ Fp ซึ่งเป็น structure factor ของโปรตีน เอาไปใช้สร้าง electron density map วาดรูปโปรตีนออกมาได้ :)

โอ้ววว เหนื่อยครับเขียนตั้งแต่ 5 ทุ่ม ยันตี 2 ล่ะ ยังไม่เสร็จ ได้แค่ 40% เอง
เอาเป็นว่าค้างไว้่เท่านี้ก่อนนะครับแล้วเดี๋ยวจะมาต่อ .......




 

Create Date : 20 มิถุนายน 2553    
Last Update : 21 กรกฎาคม 2553 23:22:15 น.
Counter : 979 Pageviews.  

Protein Crystallography: Crystal Symmetry และ Bragg'sLaw แบบย่อๆ

Prerequisite; โปรดอ่าน Blog ก่อนหน้านี้เพื่อจะได้ทำความเข้าใจบทนี้ได้ดียิ่งขึ้น

หลังจากที่ทิ้งเอาไว้ที่ว่า จุดดำๆ(reflections)บน diffraction pattern คือ resulting wave ย่อยๆที่รวมตัวกันจนเป็น wave ที่มี intensity สูงพอที่จะไปปรากฏบน detector ได้ คำถามคือว่า จุดแต่ละจุดนั้น เป็นผลมาจาก electron ตัวไหนของโปรตีน นอกจากนี้แล้ว สิ่งที่เราได้เป็นเพียงแค่จุดดำๆที่มาจากคลื่นย่อยๆร่วมตัวกัน หมายความว่าเราได้แค่ intensity (Amplitude) ของคลื่นผลลัพธ์(resulting wave) แต่เราไม่ได้รูู้้ phase ของคลื่นย่อยๆที่มารวมกัน และ phase นี่เองแหละครับที่จะเป็นตัวบอกตำแหน่งจุดหักเหของคลื่นแต่ละคลื่นย่อย ซึ่งจุดหักเหหที่ว่าก็คือตำแหน่งของ electron นั่นเองครับ


รูปที่ 1

จากรูปที่ 1 ที่ให้ดูไม่มีอะไรมากเพราะประเด็นที่จะชี้ให้ดูมีเพียงแค่ว่า ถ้าเรารู้ Phase ของแต่ละคลื่น เราก็จะสามารถระบุตำแหน่งของ electron ที่เป็นต้นต่อของการ scattering (กระเจิง/หักเห) ของคลื่นได้

------ นอกจากปัญหาเรื่อง phase แล้ว เรายังมีปัยหาที่ว่า สิ่งที่อยู่ภายใน crystal คือโมเลกุลของ protein เป็นแสนเป็๋นล้านโมเลกุลเลย แปลว่ามันต้องมี electron เป็นหลายล้านที่จะพากันกระเจิงแสน x-ray แล้วไปสร้างจุดดำๆบน detector แต่สิ่งหนึ่งที่เป็นธรรมชาิติของ crystal คือ แม้ว่าจะมีโปรตีนเป็นล้านตัว แต่ทุกตัวมันเหมือนกันหมดใช่ไหมครับ ดังนั้นข้อมูลที่ได้ ก็จะเป็นข้อมูลซ้ำๆ ออกมา ดังนั้นถ้าเราสามารถจัดการกับข้อมูลเพียงชุดเดียว ตัดที่ซ้ำออกไป การ process ข้อมูลก็จะง่ายขึ้นอย่างมากมาย นี้จึงเป็นเหตุที่เราต้องใช้ symmetry มาช่วยจัดการในเรื่องนี้ และ bragg's จะเข้ามาช่วยในเรื่องกำหนดข้อแม้ว่า ณ ตำแหน่งไหนกันของ crystal ที่จะสามารถสร้า่งจุดดำๆ (เกิด relection)บน detector ได้ ซึ่งจะนำพาช่วยให้เรากำหนดรูปแบบลักษณะโครงสร้างภายในของ crystal ว่ามันควรจะต้องเป็นแบบไหน ที่จะทำให้มันกระเจิงแสงในลักษณะททำให้ี่แสงที่เกิดจากการหักเห (ผมมักเรียกว่าแสงย่อยๆ)สามารถเกิดการแทรกสอดในรูปแบบที่รวมตัวกันได้ เป็น resulting wave ที่มี intensity สูงขึ้น-------

ี้บทบาทของ Bragg'law

ฺBragg's law ช่วยเข้ามาอธิบายความหมายของ Path difference (หรือ Phase shift) ของคลื่นๆที่สะท้อนออกมาจาก electron ใน crystal ว่ามี model อย่างไร.


รูปที่ 2

จากรูปที่ 2 แสดงตัวอย่างว่าสมมุติให้มีระนาบ 2 ระนาบที่คลื่นไปตกกระทบแล้วสะท้อนออกมาโดยคลื่นที่สะทอ้นออกมาจากทั้ง 2 ระนาบจะรวมตัวกันกลายเป็นคลื่นเดียวได้เมื่อ Bragg's law เป็นจริง นั้นก็คือ ระยะห่างระหว่าง 2 ระนาบ(d) ความยาวคลื่น(แลมด้า)และมุมตกกระทบต้องสอดคล้องกันตาม ฺBragg's law.

ตอนนี้เพื่อให้เข้าใจ Bragg ว่าเค้ามอง Crystal อย่างไร; ต้องลองนึกภาพว่าสิ่งที่อยู่ภายใน crystal คือมี electron กระจายอยู่เต็มไปหมด แต่เราเลือกที่จะขีดเส้นตรงแบ่งมันเป็นชั้นๆ electron ที่อยู่บนเส้นตรงเดียวกัน ถือว่าเป็น electron บนระนาบเดียวกัน และที่สำคัญ เราเลือกที่จะขีดเส้นตรงแบ่งระนาบให้ถี่ขนาดไหนก็ได้ แต่มีข้อแม้ว่า ระยะห่างระหว่างระนาบต้องสอดคล้องกับ ความยาวของคลื่น x-ray แล้วมุมที่คลื่นมาตกกระทบ ถึงจะทำให้คลื่นที่สะท้อนออกมาจาก set ของระนาบเหล่านั้นรวมตัวกันได้



*******Set ของระนาบหมายถึง ระนาบแต่ละระนาบที่อยู่ห่างกันเป็นระยะ d**** เช่นอย่างที่บอก ว่าเราออกแบบขีดเส้นแบ่งระนาบโดยจะให้มี d ค่าไหนก็ได้ ดังนั้นเราออกแบบแบ่งระนาบได้หลาย set แต่ละ set คือกลุ่มระนาบที่มี d แตกต่างกันไป หากแต่ เราสนใจเฉพาะ set ระนาบที่มี d ที่ทำให้เิกิดการรวมตัวกันของคลื่น สอดคล้องกับ Bragg's law *********

สังเกตุได้ว่า จาก Bragg's law เรามองว่าการเลียงตัวของ electron ใน crystal มันเรียงตัวกันเป็นชั้น คือเป็นระนาบวางซ้อนๆกัน โดยไม่ใช่ทุกระนาบที่จะสะท้อนคลื่นที่สามารถรวมตัวกันได้ แต่เป็นเฉพาะ set ของระนาบเฉพาะ set ที่แต่ละระนาบห่างกัน d ซึ่ง่จะทำให้ Bragg's law เป็นจริง ถ้าถามว่าแล้วมุมตกกระทบจะมีผลอย่างไร เพราะว่ามุมตกกระทบก็เป็นตัวแปรหนึ่งใน Bragg's law ก็ตอบว่ามีผล เพราะในการทดลองเราจะทำการหมุน crystal ไปที่ละองศา,2 หรือ 3 หรือ 4 องศาก้แล้วแต่... แล้วเราจะยิง crystal ด้วย x-ray ทุกครั้งที่ทำการหมุน crystal ดังนั้น จุดดำๆที่ได้บน diffraction pattern ก็จะมาจากการสะท้อนของคลื่นที่มาจาก set ของระนาบแต่ละ set ใน crystal (โดย set ระนาบเหล่านั้นต้องสอดคล้องตาม Bragg's law คลื่นจึงเกิดการรวมตัวกันได้) ก็จะเห็นว่ายิ่งมุมการหมุน crystal ด้วยมุนเล็กละเอียดเท่าไหร่เท่ากับว่าเราอนุญาติให้เิกิด set ของระนาบ(ที่สอดคล้องกับ Bragg) มาขึ้นเท่านั้น อีกทั้งยิ่งค่าความยาวคลื่นน้อยลงมากเท่าไหร่ ค่า d ก็จะน้อยลง แปลว่าเราสามารถซอยระนาบใน crystal ได้ถี่มากขึ้นเท่ากับว่าโอกาสที่จะได้ set ของระนาบที่จะสะท้อนคลื่นเกิดการรวมตัวกันก็มีมากขึ้นเท่านั้น ทำให้เราได้ข้่อมูล (จุดดำๆ) เยอะขึ้น ทำให้มีโอกาสที่จะเห็น electron หลายตัวมากขึ้น ภาพของโปรตีนที่จะได้ก็จะคมชัดมากขึ้นนั่นเอง (resolution power สูง เมื่อใช้คลื่นความถี่สั้นๆ)

ทีนี้เมื่อรู้แล้วว่าจุดดำๆแต่ละจุด คือผลรวมของคลื่นที่สะท้อนมาจากระนาบใน crystal ที่สอดคล้องกับ Bragg ต่อไป เราจะกำหนดตำแหน่งบนระนาบนั้นอย่างไร หรือหมายถึง จะทราบได้ไงว่าระนาบมันอยู่ตรงไหนใน crystal เรื่อง symmetry จะเข้ามาช่วยจัดการ สำหรับผม symmetry เป็นเรื่องยากที่สุดแล้วสำหรับวิชา x-ray crystallography และมีรายละเอียดเยอะมากๆๆๆ แต่ใน blog นี้ผมขอพูดแค่คร่าวๆว่าเขาเอา symmetry มาช่วยจัดการกับ crystal ยังไง

เริ่มที่ขอให้รู้ไว้ก่อนว่าวัตถุประสงค์การใช้ symmetry มาช่วยก็เพื่อต้องการกำหนดหน่วยเล็กๆที่สุดให้แก่ crystal โดยหน่อยเล็กที่ว่าจะต้องมีหน้าตาเหมือนกันทุกประการ โดยสามารถสร้าง cystal ได้็ด้วยการเรียงหน่วยเล็กๆนี้เหมือนกับการก่ออิิฐฉาบปูนนั่นแหละครับโดยมองว่าหน่วยเล็กๆที่ว่าเป็นก้อนอิฐยังไงยังงั้น ดังนั้นจะเห็นว่าวิธีนี้ี่ทำให้เราลดข้อมูลในการจัดการกับ crystalได้อย่างมหาศาล โดยตัดข้อมูลที่ซ้ำออก และจัดการกับข้อมูลเพียงแค่พอที่จะทำเรารู้แค่หน้าตาหน่วยเล็กๆดังกล่าว เราก็สามารถสร้าง crystal ได้แล้ว

การใช้ symmetry ก็คือการสร้างกฏเกี่ยวกับการจัดเรียงตัวของอะตอมใน crystal โดยให้มองว่า crystal เกิดจากหน่วยที่เล็กที่สุดที่เหมือนก้อนอิฐเรียกว่า unit cell มาทำการเรียงซ้อนกันจนได้เป็น crystal ขึ้น ระบบการจัดเรียง crystal หรือที่เรียกว่า crystal system นั้นเกิดขึ้นได้ 7 แบบซึ่งพิสูจน์ได้จากคณิตศาสตร์ล้วนๆ 7 แบบที่ว่าก็คือ triclinic, monoclinic, orthorhombic, tetragonal, rhombohedral, hexagonal และ cubic.

รุปร่างของ Unit cell ของ crystal ก็จะถูกกำหนด crystal system ซึ่งจะมีไม่เกิน 7 แบบ (แต่ในแต่ละ system การเลือก unit cell จาก lattice point อาจทำได้หลายแบบ ดังนั้นเราจะได้ชนิด unit cell มากกว่า 7) dimension และมุมของแกน a, b, c ของ unit cell จะมีขนาดเท่าไหร่ ก็ขึ้นอยู่กับ crystal แต่ละชนิดไป การกำหนด unit cell ใน crystal กำหนดโดยมีเงือนไขที่ว่า ถ้าเราจะซอย crystal ออกเป็นหน่วยย่อยที่เล็กที่สุด ก็ทำการโดยต้องให้องค์ประกอบใน unit cell เหมือนกันทุกประการ แปลว่าทุก unit cells จะมี atom ชนิดเดียวกัน วางวอยู่บนพิกัดเดียวกันของ unit cell

หลักการกำหนด unit cells คือ เมื่อมองไปใน crystal จะเห็นมันมี electron/โมเลกุลโปรตีน แยะเยะมากมาย แต่อย่างที่บอกไปแล้วว่า crytal เกิดจากการเลียงตัวซ้ำของโมเลกุล ดังนั้นถ้าลองทำการกำหนด จุด ลงไปใน cyrstal แล้วพบว่าแตล่ะจุดถูกห้อมล้อมด้วยสิ่งแวดล้อมเดียวกัน จุดนั้นเราจะเรีัยก lattice point แล้วจาก lactice point เราก็จะกำหนดขอบเขตของ unit cell ขึ้นมา (นึกถึงว่า lattice point คือจุดที่ลอยอยู่ใน crystal ที่เป็นจุดที่เลียงตัวกันซ้ำในแนว 3 มิติ) โดยมีข้อแม้ว่า unit cells จะเป็นกล่องที่เล็กที่สุดที่วางลงไปใน space ของ lattice point แล้วจะได้ environment ภายใน unit cells เหมือนกัน

ถึงตอนนี้ เราได้เงือนไขการกำหนด unit cell แล้วนะ จากนั้น เค้าก็จะมีกฏซึ่งพิสูจน์โดยคณิตศาสตร์ว่าด้วยเรื่องการเติมอะตอมลงไปใน unit cell ซึ่งวิธีการเิติมอะตอมใน unit cell จะใช้วิธีทาง symmetry คือเช่น การหมุน, การเคลื่อนที่ตามแนวแกน x, y, z โดยทำการวางอะตามแต่ะละอะตอมลงไปตามเงือนไขทาง symmetry ก็แปลว่าเราจะสามารถอธิบายการปรากฏอยู่ของอะตอมแตะละตัวใน unit cells, symmetry operation ที่ใช้นี้เราเรียกว่า space group.

ดังนั้น ข้อมูลในการกำหนดตำแหน่ง electron หรือ อะตอม ใน crystal เราต้องการทราบ 2 อย่างที่สำคัญคือ unilt cells และ space group.

เมื่อเรากำหนด crystal system แล้ว เราสามารถจำลองการ diffraction pattern ของคลื่นที่ส่องผ่าน crystal ที่มี system ต่างๆและ space group ต่างๆ

สิ่งที่เราทำในการทดลองก็คือ เปรียบเทียบ diffraction pattern ที่ได้จากการทดลองจริงกับแบบจำลอง ก็จทำให้เราทราบว่า cyrstal ของเรามี unit cells หน้าตาเป็นอย่างไร และมี space group แบบไหน แต่เรายังไม่สามารถทราบได้ว่า unit cells มี dimention เท่าไหร่

ี้อย่างที่บอกไปว่าเรามี crystal system เพียงแค่ 7 แบบ แต่สิ่งที่ทำให้เกิดการแตกต่างของ crystal เป็นร้อยเป็นล้านชนิดคือ dimention ของ unit cell ครับ คือนอกจากจะรู้ว่า unit cell เป็น tetragonal แล้วนะ เราต้องรู้ว่าแกน x,y,z และมุมของ unit cell (กล่อง) นั้นๆมีขนาดเท่าไหร่

Bragg's law เข้ามาช่วย make sense ในเรื่องขนาด ของ d จำได้ไหมครับ d คือระยะห่างระหว่างระนาบของ lattice โดยเราสามารถเชื่อมความสัมพันธ์ระหว่าง d (ที่ระบุตำแหน่งด้วย Miller index (hkl) ซึ่งเป็นสิ่งสมุติ สอดคล้องกับตำแหน่ง reflaction ที่ได้บน detector) และระยะห่างระหว่างจุด lattice point (จุดสมมุติเหมือนกันแต่จะเอาไปใช้สร้าง unit cell) ได้โดยที่ความสัมพันตรงนี้อธิบายได้โดย laue equation ครับ ดั้งนั้นแปลว่าถ้าเราทราบขนาดระยะห่างของ reflection ณ พิกัด hkl ในระบบ 3มิติ จะทำให้เรากำหนดขนาด unit cells ของ crystal ได้


รูปที่ 3

ถึงขั้นตอนนี้ เราได้สามารถหาวิธีระบุ unit cells ได้แล้วว่าหน้าตาเป็นอย่างไร จากการใช้ reflections hkl แล้วแล้วเปลี่ยนมันไปเป็น dimention ของ unit cell โดย Bragg, แต่เรายังไม่รู้ตำแหน่ง electron ใน unit cells เลยครับ ซึ่งหากเราจะทราบตำแหน่งของ electron ใน unit cells ได้ เราจำเป็นต้องทราบ phase ของคลืนที่สะท้อนมาจาก hkl ใน unit cells นั้นๆ และปัญหานี้ก็คือ Phase problem นั่นเองครับ ต้องใช้เทคนิคอื่นๆมาช่วยแก้ต่อไป

นี่ขนาดเขียนยาวแล้ว แต่ดูแล้วคำอธิบายยังหยาบอยู่มากๆ เรื่องนี้จำเป็นต้องใช้ภาพประกอบมากๆ แล้วสมการคณติศาสตร์เพื่อให้เห็นที่มาที่ไปของแต่ละตัวแปล แต่คำอธิบายคือ idea ที่เค้าเอาไปใช้ในเทคนิด crystallography ครับ เข้าใจ idea แล้ว ต่อไปจะอธิบายที่ละจุดๆโดยละเอียด ก็จะเข้าใจที่มาที่ไปง่ายขึ้น


โอ้ เหนือยมากๆครับสำหรับ blog นี้ ผมนั่งพิมพ์ 4 ชม. ต่อเนื่องกันเลย
ดังนั้น เข้ามาอ่านแล้ว comment หน่อยนะครับ จะได้ดีใจ
มีคำแนะนำอะไรก็เชิญเลยครับ รับฟัง

ใครที่ต้องการจะ discuss เกี่ยวกับ protein crystallography ก็ยินดีครับ
ใครใช้เทคนิคนี้อยู่ก็เปิดเผยตัวด้วยนะครับ จะได้ติดต่อกันไว้เป็นช่วยเหลือเป็นที่ปรึกษากัน :)

คราวต่อไป อาจจะมาลงวิธีการทำ data processing โดยการใช้โปรแกม mosflm ซึ่งเป็น program ที่ถูกพัฒนาโดย cambridge แล้วผมก็ใช้เป็นแต่ program นี้ครับ เคยใช้ denzo ตอนเรียนที่ imperial แต่พอมาที่ cambridge อาจารย์ผมใช้ mosflm ก็เลยต้อง mosflm ตาม ทั้งๆทีหลายๆคนบอกว่า denzo ใช้ง่ายกว่า แต่ส่วนตัวผม ผมว่า mosflm ก็ไม่ได้ใช้ยากเลยแล้วเดี๋ยวจะมาเล่าให้ฟังว่าผม process dataset ของผมยังไง

แล้วคุยกันใหม่ครับ




 

Create Date : 19 มกราคม 2551    
Last Update : 21 มกราคม 2551 8:34:37 น.
Counter : 1794 Pageviews.  

Protein Crystallography จาก crystal สู่ Diffraction Patter จนได้ Electron density Map

ค้างไว้เกือบ 2 ปีเลยทีเดียวหลังจากที่ Intro ค้างไว้เกี่ยวกับ Protein Crystallography

วันนี้ได้จังหวะเหมาะอีกครั้งที่จะมาลงทุนลงแรงเขียน Blog ที่ใช้พลังงานมากที่สุด ไม่สัญญาว่าจะเขียนไปจนจบได้หรือไม่ เพราะอย่างที่เห็น จาก Intro จนถึงบทนี้ ก็ปล่อยให้รอนานร่วม 2 ปีเลยทีเดียว :)

ผมจะพยายามเขียนให้ง่ายที่สุดเพื่อให้คนทั่วไปอ่านได้รู้เรื่อง ดังนั้น Blog นี้จะตั้งเป้าหมายแค่เพียงให้คนที่อ่านได้รู้เรื่อง X-ray crystallography คร่าวพอเป็น idea ไปต่อยอดได้ แล้วที่สำคัญสุดคือต้องง่ายพอที่คนทั่วไปที่ไม่มีพื้นฐาน แต่สนใจรู้ไว้ใช่ว่าเสียหาย อ่านแล้วเข้าใจว่าพวก structure biologist เค้าใช้ เทคนิคทาง biophysics นี้ไปศึกษารูปร่างของ protein ได้อย่างไร

รูปที่ 1

จากรูปที่ 1 แสดงหลักการของการใช้ x-ray cryst. เพื่อศึกษา protein structure. ขยายความโดยย่อคือ เมื่อเราสนใจที่อยาจะรู้ว่า protein หนึ่งมันมีรูปร่างหน้าตาอย่างไร เราเริ่มด้วยการผลิต prtein ตัวนั้นออกมาให้อยู่ในรูป soluble form (สารละลาย) การผลิต protein จะใช้เทคนิคทาง molecular และ biochem เช่น cloning, expression และ purification. พอได้ protion solution แล้ว เราก็ำทำการตกผลึก protein ตัวนั้นโดยหลักการการตกผลึก protein ก็เหมือนการตกผลึกสารส้มเลย (แต่ protein จะมีการใส่สารเคมีบางออย่าง และใช้เทคนิคเพิ่มความเข้มข้นของ protein ที่หลีกเลี่ยงการใช้ความร้อน โปรตีนจะตายได้ถ้าเจอความร้อน) พอได้ผลึก (crystals) ของ protein แล้ว เราก็เอามันไปยิงด้วย x-ray ยิ่งแสง x-ray มีความยาวคลื่นสั้นเท่าไหร่ resolution power ในการที่มองเห็น protein ยิ่งดีขึ้นเท่านั้น และนั่นคือสาเหตุว่าทำไม เราถึงต้องการแสง Synchrotron เพื่อการณ์นี้

เมื่อ protein ถูกยิงด้วยแสง x-ray สิ่งที่เกิดขึ้นคือ แสง x-ray จะไปชนเข้ากับ electrons บนที่อยู่โมเลกุลของโปรตีน ทำให้แสง x-ray เกิดการกระเจิงหักเหแตกต่างกันไปตามมุมและระนาบที่ตกกระทบบน electron การที่แสงกระเจิงออกเป็นหลายๆแสงดังนี้ ก็จะทำให้เกิดโอกาสที่แสงจะรวมตัวกัน หรือ จะทำลายล้างกันไปก็ได้ หากมันเกิดการรวมตัวกัน มันก็จะได้เป็นแสงที่มี intensity สูงมากพอและวิ่งผ่านไปตกกระทบลงบน detector ที่วางไว้หลัง crystal (ดูรูปที่ 1) ทำให้เกิดเป็นจุดสีดำบนจอ detector แต่ละจุดก็คือ intensity ของแสงที่เป็นผลลัพธ์จากแสงย่อยๆร่วมตัวกันนั่นเอง จุดหลายๆจุดที่เห็นบน detector นั่นเราเรียกรวมกันว่า diffraction pattern นั่นเอง และสำหรับแสงที่มันหักล้างกันไป ก็จะหายไปและไปไม่ถึง detector

จุดดำๆแต่ละจุด มีความหมายมากครับ พอที่เราจะเอาไปคำนวณเพื่อคลำทางไปยังต้นตอว่า จุดนี้เกิดจากตกกระทบของแสงที่มาจาก electron ใด นั่นแปลว่า แต่ละจุดบน diffraction pattern เป็นแผนที่บอกใบให้เรารู้ว่ามันจากจาก electron ตัวไหนบน protein ดังนั้นแล้ว ถ้าเรารู้ตำแหน่ง electron บน protein ได้แล้ว ก้เท่ากับว่าเราจะรู้รุปร่างของ protein ทันที เพราะ protein สร้างมาจาก อะตอม และอะตอมก็มี electron เป็นองค์ประกอบใช่ไหมครับ เราเคยเล่นเกมวาดภาพต่อจุดไหมครับตอนเด็กๆ ที่ให้เราลากเส้นจากจุด 1 ไป 2 ไป 3..4..5..... จนถึงจุดสุดท้ายเราก็จะรู้ว่าเราไ้ด้วาดภาพอะไรไป เหมือนกันเลยครับ จุด ในเกมส์วาดรูปนั่น ก็คือตำำแหน่ง electron บน protein ดังัน้น electron ก็เหมือนแผนที่ที่จะให้เราวาดภาพ protein ลงไปนั่นเอง และผลลัพธ์จากการตีความหมาย diffraction pattern เราจะได้ electron density map ที่พร้อมจะให้เราเอาไปใช้วาด protein ลงไป

ทีนี้เมื่อเข้าใจหลักการที่เล่าให้ฟังข้างบนแล้ว ทีนี้ลองนึกตามนะครับว่า แสงที่กระเจิงแล้วรวมตัวกันจนได้เป็นแสดงเดียวที่เข้มขนจนเกิดเป็นจุดดำบน detector ได้นั้น มันมีเงือนไขในการรวมตัวกันอย่างไร

แล้ว electron บนใน crystal มีเป็นพันล้าน electron เราจะไหวเหรอที่จะคำนวณ 1 by 1 ย้อนกลับไปหาต่ำแหน่ง electron แต่ละตัว

คำตอบของ 2 คำถามนั่นคือ Bragg's law และ Symmetry ครับ

Bragg ได้โนเบลจากการศึกษาเรื่องนี้ที่ Cambridge ทำให้เกิดความก้าวหน้าในการใช้ x-ray diffraction อย่างมากมายเมื่อ Bragg สามารถอธิบายเงื่อนไขกระกระเจิงของแสงใน crystal ว่ามันต้องมีรูปแบบใดที่จะทำให้มันรวมตัวกัน (constructive interference) พร้อมทั้งเสนอ model โครงสร้างภายใน crystal ว่ามันจะมีลักษณะเหมือนเป็นชั้นบางๆโปรงแสง(แต่สามารถสะท้อนคลื่นได้) ที่เรียงตัวซ้อนกันเป็นชั้นๆ ทำให้การสร้างสมการการรวมคลื่นเกิดขึ้นได้อย่างสอดคล้องกับสิ่งที่เกิดขึ้นจริงใน crystal ถัดมา่จากนั้น Watson และ Crick ก็เอาเทคนิค x-ray diffraction นี้ไปใช้จนสามารถค้นพบว่ารูปร่าง DNA มีลักษณะอย่างไร และได้รางวันโนเบลจากงานนั้น งานนี้ก็เกิดขึ้นที่ Cambridge :)

อีกคำถามสำคัญคือ ถ้าอยากจะรู้เกี่ยวกับต่ำแหน่งการตกกระทบของคลื่นเนี่ย phase เป็นข้่อมูลที่สำคัญมากๆ ซึ่งจากที่ผมอธิบายไปข้างบน จะเห็นว่าผลจากการทดลองเราได้แค่ diffraction pattern ซึ่งมี่แต่จุดดำๆ นั่นแปลว่า เราวัดไแ้แต่แค่ intensity ของ resulting wave (คลื่นผลลัพธ์ที่เกิดจากการร่วมตัวของคลื่นที่กระเจิง) แต่เราไม่รู้อะไรเกี่ยวกับ phase ของคลื่นแต่ละคลื่นที่มารวมตัวกันเลย และถ้าไม่มี phase เราก็จะไม่มีทางทราบได้เลยว่า คลื่นแต่ละตัวมาจากตำแหน่งไหนกันบ้าง ปัญหานี้เป็นปัญหา classic ของงานนี้เลครับซึ่งคนใน field เรียกปัญหานี้ว่า phase problem ครับ ซึ่งเราก็มีวิธีการแก้ปัญนี้กันหลายวิธี ไม่ว่าจะใช้เทคนิค molecular replacement, isomorphous replacement, anomalous dispersion ซึ่งก็จะค่อยเล่าให้ฟังกันต่อๆไปในภายหลังเทคนิดเหล่านี้ก็มีแตกย่อยไปอีก เรียกันประหลาดๆเช่น SAD, MAD, SIR, MIR, MIRAS ซึ่งก็จะเอามาเล่าให้ฟังแน่ๆครับ

แต่ก่อนจะไปถึง phasing technique มันต้องคุยกันเรื่อง Bragg'law กันก่อน แต่ขออนุญาตไปเล่าเรื่อง Bragg's law กับการค้นพบเงื่อนไขการกระเจิงและรวมตัวกันของแสงที่ใน crystals รวมถึงบทบาทของ Symmetry ที่จะช่วยเข้ามาทำให้ความซับซ้อนใน cystal มันง่ายขึ้น ใน Blog หน้านะครับ ตอนนี้ตี 3 ครึ่ง แล้วครับขอไปพักผ่อนก่อน




 

Create Date : 19 มกราคม 2551    
Last Update : 21 มกราคม 2551 7:46:32 น.
Counter : 1092 Pageviews.  

บทเริ่มต้นของการศึกษารูปร่าง 3 มิติของ Protein ด้วยเทคนิค X-ray Diffraction

ตามสัญญาครับที่ว่าจะเขียน Blog เกี่ยวกับการใช้เทคนิค X-ray Diffraction เพื่อศึกษารูปร่าง 3 มิติของ Proteins

หากว่ากันจริงเรื่องนี้เป็นเรื่องที่ยาวมากๆๆครับ แล้วก็ต้องใช้ความเข้าใจและจินตนาการที่ซับซ้อนพอสมควร แต่เมื่อผมตัดสินใจเอาที่จะเอามันมาทำเป็น Blog แล้ว ก็ขอเขียนอะไรให้ง่ายๆเข้าไว้ก่อน หากใครต้องการรายละเอียดเพิ่มเติม เราก็สามารถติดต่อผ่านทางนี้ได้ครับ หากผมรู้ ผมก็จะเอามาเล่าสู่กันฟัง

ในบทแรกนี้ จะขอพูดกว้างๆเกี่ยวกับแนวคิดของเรื่องนี้ มันเริ่มจาก เมื่อถึงจุดๆหนึ่งที่เรามีความเข้าใจแล้วว่าองค์ประกอปของสิ่งมีชีวิตมี Protein เป็นองค์ประกอปหลัก มันไม่ใช่เป็นเพียงเนื้อ หนัง ผม ผิว กระดูก ฟัน หรือ แก้วตา หากแต่มองลงไปในระดับเซลล์ ก็จะพบว่าภายในเซลล์มีปฏิกิริยาเคมีเกิดขึ้นเป็นเป็นล้านๆปฏิกิริยาในแต่ละนาที และแต่ละปฏิกิริยาเคมีนั้นก็ถูกควบคุมโดยโปรตีนที่เราตั้งชื้อมันว่า Enzyme

เรารู้ว่าโรคร้ายแรงทางพันธุกรรมเกิดจากที่ร่างกายไม่สามารถผลิต protein บางชนิดได้ หรือผลิตออกมาก็ไม่สมบูรณ์ทำงานไม่ได้ หรือทำงานได้ดีเกินเหตุ

หรือเชื้อโรคอย่าง HIV เองก็ตาม การที่มันจะก่อโรคในร่างกายได้ มันก็ต้องใช้โปรตีนของมันเพื่อให้มันมีชีวิตแล้วเข้ามาทำร้ายเรา

ดังนั้นแนวคิดว่าที่ หากเราเข้าใจการทำงานของ protein ได้ดีแล้ว เราอาจบังคับให้ protein หนึ่งๆ ทำงานได้ หรือ หยุดทำงานไป เพื่อป้องกันและรักษาโรคร้าย หรือแม้กระทั้งออกแบบยาให้ไปโจมตีเชื้อโรคโดยการไปทำลาย protein ที่สำคัญของมัน

และหากจะเข้าใจการทำงานของ protein ได้ดี ลำพังแค่ความเข้าใจการควบคุมการผลิต protein ในระดับ transcription (การผลิต mRNA) และการ translation(การผลิต protein จาก mRNA) อาจไม่เพียงพอ ดังนั้นเราจึงมีแนวคิดว่า ถ้าเราสามารถมองเห็นโปรตีนได้ เราอาจได้ความรู้ที่มีประโยชน์มากมาย และนำเราไปสู่แนวทางในการควบคุมการทำงานของโปรตีนได้อย่างมีประสิทธิภาพ

ที่กล่าวมาเป็นเพียง idea เสี้ยวหนึ่งเท่านั้นของประโยชน์จากการศึกษาโครงสร้าง 3 มิติของโปรตีน ถ้าใครสนใจก็ลองหาอ่านเพิ่มเติมได้ จาก google เยอะแยะครับ key worlds ที่แนะนำเช่น protein and didsease , protein structure, drug design, protein engineer

อืม... แล้วทำไมต้อง รูปร่าง 3 มิติด้วยล่ะ
ก็เพราะรูปร่างของวัตถุใดๆ มันเป็น 3 มิติใช่ไหมครับ ดังนั้นเวลาศึกษาดูถึงรูปร่างจริงๆ มันก็ต้องเป็นระบบ 3 มิติ

แล้วทำไมเน้นคำว่า 3 มิติ จัง ก็เพราะแต่ก่อนกาลที่เราจะสามารถมองเห็นโปรตีนได้ เราทำได้เพียงแต่ใช้เทคนิคทางเคมีวิเคราะห์ลำดับกรดอะมิโนโปรตีนเท่านั้นเอง แล้วก้เอามาวาดลง text book มันเป็นเพียงแค่ 2 มิติ แต่พอเราได้มองเห็นรูปร่าง 3 มิติของโปรตีนได้แล้ว ข้อมูลที่ได้จาก 3 มิติ มันเป็นคนละเรื่องกับ 2 มิติอย่างสิ้นเชิง

เทคนิคที่ใช้ศึกษารูปร่างของโปรตีนก็มีที่เด่นๆอยู่ 3 เทคนิคครับ เด่นสุดๆๆๆคือ X-ray Crystalloography (หรือ X-ray Diffraction) ลองลงมาก็ กล้องจุลทัศอิเล็คตรอน และที่กำลังพัฒนาอย่างก้าวกระโดดตอนนี้คือ NMR

ใน blog ของผม ผมขอเล่าแค่ X-ray แล้วกันนะครับ เพราะคิดว่าแค่นี้ ไม่รู้ว่าจะใช้เวลากี่เดือนกว่าจะเขียนเสร็จ เหอๆ เพราะมันขี้เกียจอ่ะ


อ่ะ ตอนนี้คงจะถึงเวลาตั้งคำถามว่าแล้ว X-ray Crystallography คืออะไร ?

อ่านต่อไปครับ



รูปนี้คือรูปร่าง 3 มิติของโปรตีนที่เราอยากเห็นกันเหลือเกิน

(นำมาจาก //bioc.polytechnique.fr)


เทคนิค X-ray Crystallography โดยทั่วไปก็มีขั้นตอนง่ายๆครับ อิอิ คือ
1. เอาดปรตีนที่ต้องการศึกษามาทำการตกผลึกเพื่อให้ได้คริสตัลของโปรตีนออกมาก่อน

2. มีคริสตัลแล้ว ก็เอาแสง X-ray มาฉายลงไปยังผลึก แสง X-ray ก็จะวิ่งเข้าไปยังผลึกแล้วไปชนกับ electron บนโมเลกุลของ protein ที่อยู่ในผลึก ทำให้เกิดการกระเจิงของแสง x-ray แตกแยกกระจัดกระจายออกเป็นคลื่นแสงหลากหลายความถี่ หลายกหลาย phase พุ่งไปทั่วทุกทิศทุกทาง (ยกเว้นทิศที่ขนานกับทิศทางของแสง X-ray ที่เป็นแหล่งกำเนิด ผลคือแสงเล็กแสงน้อยที่กระเจิงเพราะผลการชนกับ electron มันก็จะเกิดการ รวม และหักล้างกันไป ถ้ามันหักล้างกัน ก็จบไป แต่ถ้ามันรวมกันกลายเป็นแสงที่มี amplitude สูง เราก็สามารถเอา detector มาวัดได้

ผลจากการวัดความเข้มแสงที่เป็นผลลัพธ์จากการรวมตัวกันของแสงย่อยๆที่กระเจิง ก็จะเกิดเป็นจุดๆๆๆ intensity บน detector นั่นเอง เมื่อจบการทดลอง เราจะได้ข้อมูลที่เป็นรูปภาพจุดดำๆบน detector เราเรียกมันว่า diffraction pattern ดังภาพนี้





(นำมาจาก//csbcc1.csbcc.dartmouth.edu)

รูปล่างนี้สรุปในสิ่งที่ผมเพิ่งอธิบายไปเกี่ยวกับ X-ray Crystallography ครับ

(นำมาจาก //www.stolaf.edu


บางคนอาจถามว่า ทดลองออกมาแล้วได้แค่ภาพ จุดๆๆ แค่เนี้ย แล้วไหนรูปร่าง protein ล่ะ ?

ขอบอกว่า จุดๆๆๆ แต่ละจุดมีความหมายหมดครับ เพราะมันเป็นทำหน้าที่เป็นแผนที่ลายแทงที่จะบอกเราต่อไปว่า electron ตัวไหนบนโมเลกุลโปรตีนที่ทำการสะท้อนแสงออกมาแล้วสร้างจุดแต่ละจุดบน detector

ดังนั้นงานหนักต่อไปของนักวิทยาศาสตร์คือ แกะลายแทงเหล่านี้ เพื่อเอาไปสร้างภาพให้เป็น protein 3 มิติให้ได้ในที่สุด

ใน blog นี้ผมขอหยุดไว้เพียงเท่านี้ก่อนครับ ต่อไปจะมาเล่าให้ฟังต่อว่า เขาใช้อะไรมาแกะลายแทงจุดๆเหล่านั้น จนกลายเป็นภาพโปรตีนได้ แล้วท่านจะทึ่งกับความสามารถของมนุษย์ว่า โอ้โห เราคิดกันได้ซับซ้อนขนาดนี้เลยเหรอเนี่ย ผมเองก็ยอมรับว่า X-ray Crystallography เป็นวิชาที่ผมเรียนแล้วทึ่งมากๆ เพราะความงดงานไม่ใช่เพียงแต่คริสตัลที่เราเลี้ยงจนโตดูล้วเหมือนเพชร แต่คณิตศาสตร์และฟิสิกส์ที่อยู่เบื้องหลังเทคนิคนี้ มันงดงามไม่แพ้แสงสะท้อนของคริสตัลเลย

ขอให้ติดตามกันในตอนต่อไปนะครับ

ปล. ใครมาอ่านแล้ว ช่วยลง comment ด้วยนะครับ จะได้มีกำลังใจทำ blog ต่อๆไป

แล้วเจอกันใหม่ครับ บายๆ



(นำมาจาก //marcus.whitman.edu/)




 

Create Date : 11 กุมภาพันธ์ 2549    
Last Update : 20 กุมภาพันธ์ 2549 7:12:19 น.
Counter : 3398 Pageviews.  

X-ray Crystallography



เดี๋ยวว่างๆๆๆๆๆๆๆๆๆๆ จะเอาเนื้อหาแบบเกี่ยวกับ การใช้ X-ray Crystallography มาลงครับ ตอนนี้ขอมาแค่เปิด Blog ทิ้งไว้ก่อน :)




 

Create Date : 30 มกราคม 2549    
Last Update : 29 สิงหาคม 2553 5:16:04 น.
Counter : 710 Pageviews.  


TimeS-To-Enjoy
Location :
Cambridge United Kingdom

[Profile ทั้งหมด]

ให้ทิปเจ้าของ Blog [?]
ฝากข้อความหลังไมค์
Rss Feed
Smember
ผู้ติดตามบล็อก : 9 คน [?]




สวัสดีครับ ขอบคุณที่แวะเข้ามาชม Blog ของผมกัน หวังไว้ว่าจะเอา Blog นี้เป็นที่เก็บสะสมสาระเกี่ยวกับงานที่ผมทำ เพื่อใครสนใจจะได้เอาไว้เป็นที่แลกเปลี่ยนกัน

ภูมิหลังคร่าวๆนะครับ
ตอนนี้เรียนอยู่ที่ University of Cambridge, England ครับ ความหวังจากการมาเรียนที่นี่คือ อยากจะเป็นผู้เชียวชาญในการใช้เทคนิค X-ray Cystallography เพื่อศึกษา Protein Structure หวังว่าจะได้เป็นส่วนหนึ่งที่จะทำให้ประเทศไทยก้าวหน้าไปในทางที่ดีขึ้นได้ไม่มากก็น้อย
Friends' blogs
[Add TimeS-To-Enjoy's blog to your web]
Links
 

 Pantip.com | PantipMarket.com | Pantown.com | © 2004 BlogGang.com allrights reserved.